在IVD(體外診斷)行業(yè)中，創(chuàng)新技術(shù)是推動(dòng)行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵力量。目前主流的IVD領(lǐng)域創(chuàng)新技術(shù)主要包括三代測(cè)序技術(shù)、數(shù)字 PCR、流式液相芯片、單分子免疫檢測(cè)、微流控技術(shù)、光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)、質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)。 以下是對(duì)這些創(chuàng)新技術(shù)的梳理和總結(jié)。

　　一、三代測(cè)序技術(shù)

　　三代測(cè)序技術(shù)，也被稱為單分子測(cè)序技術(shù)或從頭測(cè)序技術(shù)，其最大的特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序，且測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而避免了潛在的PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤和偏好性。

　　1.1 技術(shù)原理

　　三代測(cè)序技術(shù)的原理主要分為兩大技術(shù)陣營：

　　單分子熒光測(cè)序

　　代表性技術(shù)包括美國螺旋生物(Helicos)的SMS技術(shù)和美國太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技術(shù)。

　　技術(shù)原理：脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈時(shí)，其熒光能被探測(cè)到，并與DNA鏈形成化學(xué)鍵后，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，且合成的DNA鏈與天然DNA鏈一致。

　　關(guān)鍵技術(shù)：如Pacific Biosciences公司發(fā)明的零模波導(dǎo)孔技術(shù)(Zero-Mode Waveguides，ZMWs)，使得光只能照亮固定了單個(gè)DNA聚合酶/模板分子的納米孔底部，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子的精確測(cè)序。

　　納米孔測(cè)序：

　　代表性公司為英國牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)。

　　技術(shù)原理：采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測(cè)序。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過，而不同堿基(ATCG)的帶電性質(zhì)不一樣，因此通過電信號(hào)的差異就能檢測(cè)出通過的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序。

　　1.2 技術(shù)特點(diǎn)

　　長讀長：三代測(cè)序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)超長讀長，如PacBio的SMRT技術(shù)平均讀長可達(dá)10,000 bp，最長讀長超過20,000 bp，這有助于減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量。

　　高精度：測(cè)序精度非常高，達(dá)到99.9999%，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)DNA分子的序列信息。

　　直接測(cè)序：能夠直接測(cè)序原始DNA和RNA，無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，保留了原始?jí)A基修飾信息，如甲基化等。

　　實(shí)時(shí)測(cè)序：能夠?qū)崟r(shí)獲得序列信息，滿足動(dòng)態(tài)檢測(cè)宏基因組的需求。

　　1.3 應(yīng)用領(lǐng)域

　　三代測(cè)序技術(shù)主要用于基因組測(cè)序、甲基化研究和突變鑒定等方面。在基因組測(cè)序方面，由于其具有長讀長的特點(diǎn)，能夠降低測(cè)序后的Contig數(shù)量，減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量。在甲基化研究方面，SMRT技術(shù)能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA聚合酶的工作狀態(tài)，聚合酶合成每一個(gè)堿基都有一個(gè)時(shí)間段，當(dāng)模板堿基帶有修飾時(shí)，聚合酶會(huì)慢下來，帶有修飾的堿基兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值結(jié)果大于1，就可以推斷這個(gè)位置有修飾。在突變鑒定方面，單分子測(cè)序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且沒有PCR擴(kuò)增步驟，就沒有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤

　　二、數(shù)字PCR

　　數(shù)字PCR(Digital PCR, dPCR)是一種高靈敏度的核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，它在近年來得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。

　　2.1 技術(shù)原理

　　數(shù)字PCR是一種通過把反應(yīng)體系均分到大量獨(dú)立的微反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)泊松分布和陽性比例來計(jì)算核酸拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)定量分析的技術(shù)。其基本原理是將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，然后分配到不同的反應(yīng)單元中，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子(即DNA模板)，每個(gè)單元都會(huì)對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，然后再對(duì)每個(gè)單元進(jìn)行熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)并計(jì)算。相較于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，數(shù)字PCR不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有更高靈敏度、準(zhǔn)確度及高耐受性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的絕對(duì)定量分析。

　　2.2 技術(shù)特點(diǎn)

　　絕對(duì)定量：數(shù)字PCR能夠直接讀出DNA的分子個(gè)數(shù)，對(duì)起始樣本核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量，不依賴于擴(kuò)增曲線循環(huán)Ct值，也不受擴(kuò)增效率的影響。

　　高靈敏度：數(shù)字PCR將傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系分割成數(shù)萬個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)，可以精確地檢測(cè)很小的目的片段差異、單拷貝甚至低濃度的混雜樣本。

　　高耐受性：由于目的序列被分配到多個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系中，顯著降低了背景信號(hào)和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾，擴(kuò)增基質(zhì)效應(yīng)大大減小。

　　多樣化的樣本稀釋分配方式：目前數(shù)字PCR樣本稀釋分配的方式主要有三種：基于大規(guī)模集成微流控芯片、使用微反應(yīng)室/孔板、微滴式。其中，微滴式dPCR(droplet dPCR, ddPCR)和芯片式dPCR(chip dPCR, cdPCR)是市面上常見的兩種技術(shù)。

　　2.3 應(yīng)用領(lǐng)域

　　數(shù)字PCR特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域，如拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。此外，數(shù)字PCR還在單細(xì)胞分析、癌癥早期診斷等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

　　2.4 發(fā)展歷程

　　數(shù)字PCR的概念最早在20世紀(jì)末由Vogelstein等提出，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前全球已有超過30家相關(guān)企業(yè)致力于數(shù)字PCR技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用。從1987年第一代PCR系統(tǒng)開啟商用，到2006年第一款商業(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)Biomark HD發(fā)布，再到近年來各平臺(tái)頻繁發(fā)布新品，數(shù)字PCR技術(shù)不斷迭代升級(jí)，推動(dòng)了其在臨床和科研領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

　　三、流式液相芯片

　　流式液相芯片技術(shù)，也稱為流式熒光技術(shù)或液相懸浮技術(shù)，是一種基于微球體(或稱為微珠)的生物檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)通過在微球表面固定上特定的生物探針(如抗體、核酸等)，與待測(cè)樣本中的目標(biāo)分子進(jìn)行特異性結(jié)合，并通過流式熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量、快速檢測(cè)。

　　3.1 技術(shù)原理

　　流式液相芯片技術(shù)的核心在于編碼微球和流式熒光檢測(cè)。編碼微球直徑約為5.5～5.6μm，表面涂覆有熒光物質(zhì)，內(nèi)部則含有特定濃度的熒光染料。不同的微球通過熒光染料的不同組合進(jìn)行編碼，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同目標(biāo)分子的識(shí)別。當(dāng)微球與樣本中的目標(biāo)分子結(jié)合后，通過激光掃描檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的定量和定性分析。

　　流式熒光檢測(cè)則是利用熒光標(biāo)記的探針與待測(cè)樣本中的目標(biāo)分子進(jìn)行特異性結(jié)合，并通過流式細(xì)胞儀對(duì)微球進(jìn)行快速、連續(xù)的檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀中，微球被特定的流動(dòng)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)，逐個(gè)通過檢測(cè)區(qū)域。當(dāng)微球經(jīng)過激光束時(shí)，熒光標(biāo)記的探針會(huì)發(fā)出特定的熒光信號(hào)，這些信號(hào)被光電倍增管等光電器件接收并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，進(jìn)而通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

　　3.2 技術(shù)特點(diǎn)

　　高通量：流式液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)同一樣本中的多種不同目標(biāo)分子，大大提高了檢測(cè)效率。例如，Luminex液相懸浮芯片技術(shù)最多可一管同時(shí)準(zhǔn)確定量檢測(cè)2-500種不同的生物分子。

　　高靈敏度：該技術(shù)能夠檢測(cè)到極低濃度的生物分子，最低檢測(cè)濃度可達(dá)到2 pg/ml甚至更低(如Luminex技術(shù)的下限達(dá)0.1pg/mL)，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

　　操作簡便：流式液相芯片技術(shù)采用自動(dòng)化操作流程，減少了人為操作誤差，提高了檢測(cè)精度。

　　檢測(cè)線性范圍廣：該技術(shù)能夠覆蓋較寬的濃度范圍，滿足不同樣本的檢測(cè)需求。

　　3.3 技術(shù)發(fā)展

　　液相芯片技術(shù)是迄今為止被美國食品藥品管理局(FDA)惟一批準(zhǔn)用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。這一認(rèn)證標(biāo)志著液相芯片技術(shù)在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性得到了權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。到2005年，全球已有近200個(gè)液相芯片項(xiàng)目獲得了FDA認(rèn)證。其中，美國Luminex公司和荷蘭的QIAGEN跨國公司是液相芯片技術(shù)的領(lǐng)先企業(yè)，為全球提供了先進(jìn)的檢測(cè)平臺(tái)。在國內(nèi)，液相芯片技術(shù)也得到了快速發(fā)展。國內(nèi)廠家已生產(chǎn)了配套的自動(dòng)加樣儀系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化檢測(cè)。同時(shí)，也有多家企業(yè)推出了商品化的液相芯片檢測(cè)試劑，如上海透景公司生產(chǎn)的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)產(chǎn)品、HPV檢測(cè)產(chǎn)品等。

　　四、單分子免疫檢測(cè)

　　單分子免疫檢測(cè)是一種在蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物檢測(cè)領(lǐng)域具有突破性意義的新技術(shù)。

　　4.1 技術(shù)定義

　　單分子免疫檢測(cè)技術(shù)(如Single Molecule Counting, SMC?;single molecule array, SiMoA等)是一種通過對(duì)溶液中特定種類的單個(gè)分子進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液濃度進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。這種技術(shù)能夠直接計(jì)數(shù)單個(gè)抗原分子，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)分析，從檢測(cè)原理上打破了現(xiàn)有發(fā)光體系檢測(cè)靈敏度的瓶頸。

　　4.2 技術(shù)原理

　　單分子免疫檢測(cè)技術(shù)的主流平臺(tái)如Erenna、SiMoA等，通常利用免疫標(biāo)記的方法，通過抗體捕獲和識(shí)別抗原，進(jìn)行信號(hào)分子標(biāo)記或是酶聯(lián)標(biāo)記的形式，然后通過單分子熒光信號(hào)檢測(cè)或單分子酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的單分子級(jí)別蛋白分子的檢測(cè)。其中，以Erenna平臺(tái)為例，其利用毛細(xì)管進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記分子的上樣，并以激光聚焦的方式進(jìn)行激發(fā)檢測(cè)。當(dāng)熒光素標(biāo)記分子通過高能量的激光焦點(diǎn)時(shí)，熒光素所發(fā)射的光閃爍信號(hào)被檢測(cè)器測(cè)得。光閃爍信號(hào)的次數(shù)和強(qiáng)度與分子濃度呈正相關(guān)性，從而能建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過對(duì)一定時(shí)間之內(nèi)光閃爍信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以對(duì)溶液濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。

　　4.3 主要特點(diǎn)

　　超高檢測(cè)靈敏度：單分子免疫檢測(cè)技術(shù)的靈敏度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)，可達(dá)到ELISA的約1000倍，成功實(shí)現(xiàn)濃度在fmol級(jí)別蛋白靶標(biāo)的檢測(cè)。這種高靈敏度使得檢測(cè)超低豐度蛋白成為現(xiàn)實(shí)。

　　寬動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍：該技術(shù)具有寬至4個(gè)log的大動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，有利于蛋白靶標(biāo)表達(dá)量存在巨大差異的樣本進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

　　靈活的實(shí)驗(yàn)方案：可根據(jù)靶標(biāo)豐度和成本靈活選擇實(shí)驗(yàn)方案，既可使用磁珠又可使用普通96孔板作為抗體包被介質(zhì)，在靈敏度和成本方面取得了巧妙平衡。

　　便于自行開發(fā)檢測(cè)試劑盒：如果檢測(cè)的是全新的標(biāo)志物，商業(yè)化的整套試劑盒開發(fā)工具，可在極短時(shí)間內(nèi)開發(fā)新檢測(cè)試劑盒。

　　全自動(dòng)化與高精度：實(shí)驗(yàn)過程不依賴操作人員，從而保證結(jié)果的重復(fù)性和精準(zhǔn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的批間變異系數(shù)(CVS)低于10%。

　　4.4 技術(shù)發(fā)展

　　隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，單分子免疫檢測(cè)技術(shù)也在不斷優(yōu)化和更新。例如，Quanterix公司的SiMoA技術(shù)通過微陣列芯片實(shí)現(xiàn)單分子免疫檢測(cè)，其檢測(cè)限可達(dá)飛摩爾(fg/mL)數(shù)量級(jí)，是目前最具代表性的單分子免疫檢測(cè)技術(shù)之一。此外，國內(nèi)也有企業(yè)致力于開發(fā)并產(chǎn)業(yè)化更適合于臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的新型單分子免疫檢測(cè)系統(tǒng)，通過創(chuàng)新的單分子檢測(cè)技術(shù)的突破，顯著降低了檢測(cè)技術(shù)路徑的復(fù)雜程度、檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)通量、檢測(cè)效率和檢測(cè)的穩(wěn)定性。

　　來源于分子診斷實(shí)驗(yàn)室 ，作者研發(fā)小智