基因組測序目前在下呼吸道感染性疾病的診斷中應(yīng)用越來越廣泛，特別是對病原的檢測。
但是隨著宏基因組測序(mNGS)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，臨床發(fā)現(xiàn)mNGS在針對真菌、分枝桿菌的測序工作中，其對“破壁技術(shù)”的要求較高，技術(shù)難度也較大。
此外，如何解讀mNGS報告，如何“猜測”出有效序列，下一步應(yīng)該如何去驗證“猜測”，如何從大量的病原體中提取到目的核酸序列，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，似乎也成為了一個難題。
因此，靶向測序(tNGS)技術(shù)應(yīng)運而生。由于靶向測序(tNGS)靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測成本低且相對快速，其在結(jié)核及結(jié)核耐藥檢測、腦脊液病原體鑒定、早產(chǎn)兒下呼吸道感染的診斷等領(lǐng)域都有極高的價值。
那么，宏基因組測序(mNGS)與靶向測序(tNGS)在下呼吸道感染性疾病診斷過程中應(yīng)當(dāng)如何選擇，這兩種技術(shù)的優(yōu)勢和各自的局限性是什么，中日醫(yī)院國家呼吸醫(yī)學(xué)中心魯炳懷教授在本次講座中就為大家進(jìn)行了詳細(xì)的解讀。
一、mNGS技術(shù)的選擇與局限性
我們以下呼吸道感染為例，其病原類別非常多，包括病毒、細(xì)菌、非典型病原體、真菌、分枝桿菌等。不同人群、不同季節(jié)、不同年齡階段，誘發(fā)疾病的病原是不一樣的。
而用常規(guī)的微生物培養(yǎng)檢測方法，只能培養(yǎng)出一部分病原菌。也正是因為常規(guī)微生物檢驗的“不給力”，很多臨床醫(yī)生會選擇繞過臨床微生物室，選擇宏基因組測序(mNGS)。
目前看來， mNGS是一個非常特殊的技術(shù)，它可以對所有的病原進(jìn)行檢測。相對而言，通過mNGS對病毒進(jìn)行測序較為簡單，技術(shù)上難度相對較小。但是針對真菌、分枝桿菌的測序工作，其對“破壁技術(shù)”的要求較高，技術(shù)難度也較大。
目前，免疫抑制人群數(shù)量的增加、侵襲性真菌病(IFD)患者人數(shù)也不斷增加，給患者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
而隨著引起下呼吸道感染的侵襲性念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、新型隱球菌、卡氏肺孢子菌、地方流行性真菌、罕見真菌等的檢出率越來越高，讓臨床醫(yī)生頭疼的問題是很多患者做了mNGS后卻發(fā)現(xiàn)了三個甚至多個真菌、分枝桿菌的擴增片段，難以明確診斷。
而如何解讀mNGS報告、如何“猜測”出有效序列、下一步應(yīng)該如何去驗證“猜測”、如何結(jié)合患者的影像學(xué)結(jié)果和臨床癥狀調(diào)整用藥從而提高病原覆蓋率，似乎成為了臨床MDT或者會診的主旋律。
如何從大量的病原體中提取到目的核酸序列，從何保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，成為了一個難題。
在臨床診斷感染的時候，如果病原載量高，無論是傳統(tǒng)的微生物技術(shù)，還是宏基因組測序(mNGS)、靶向測序(tNGS)都是沒有什么問題的?，F(xiàn)在的難題是當(dāng)病原載量較低時，mNGS檢測報告應(yīng)該怎么去分析和解讀。
mNGS另一個主要的問題是為了提高靈敏度，降低了特異度。不同的公司之間結(jié)果可比性比較差，除非是病原載量比較多的時候才有一定的可比性。
當(dāng)病原量少的時候，不同的公司得到的結(jié)果是千差萬別的。為了能夠檢出的病原量更多，一些特異性數(shù)據(jù)庫中也納入了非特異的片段，這樣導(dǎo)致了和數(shù)據(jù)庫比對以后的結(jié)果，未必是特異的，更無法明確診斷。
因此建議，應(yīng)在普通庫的基礎(chǔ)上再建一個二級庫來標(biāo)定擴增序列是否特異、結(jié)果是否可靠。以分枝桿菌屬的測序為例，分枝桿菌屬是一類細(xì)長略帶彎曲，有時呈分枝狀的桿菌，細(xì)胞壁還要大量脂質(zhì)。
現(xiàn)在很多患者感染新冠、流感后易混合細(xì)菌感染或繼發(fā)鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌的感染，需要鑒別診斷。而這類患者的mNGS結(jié)果常出現(xiàn)鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌有2~3個序列的情況，難以判斷患者是否合并繼發(fā)感染了分枝桿菌。
二、“傳統(tǒng)顯微鏡涂片鏡檢與培養(yǎng)” VS 宏基因組測序(mNGS)
(一)顯微鏡涂片鏡檢：通過直觀的觀察，可見人體炎癥反應(yīng)的狀況，如白細(xì)胞聚集、吞噬情況，可以幫助臨床明確病原的存在，但是靈敏度不高。
(二)培養(yǎng)是感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但時間周期長。培養(yǎng)出活的致病菌落是藥敏試驗的前提：
隱球菌屬與曲霉菌相對毛霉菌容易培養(yǎng);
分枝桿菌推薦采用液體培養(yǎng)的手段，可提高陽性率，縮短報告時間。
在所有感染性疾病中，超過30%的呼吸道感染、超過40%~50%血流感染、以及超過50%~60%腦炎和腦膜炎，通過傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測手段(直接檢查、抗原檢測、PCR、分離與培養(yǎng))無法鑒別其病原體。
微生物培養(yǎng)可以分離的常見病原體
(三)宏基因組測序(mNGS)的靶標(biāo)是核酸，可報告耐藥基因
碳青霉烯酶耐藥基因(對于腸桿菌目細(xì)菌);
mecA基因(對于葡萄球菌);
結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因等。
從傳統(tǒng)微生物檢驗的角度來解讀mNGS的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mNGS被“擴大化”了，我們需要一種方法去校準(zhǔn)mNGS的結(jié)果，判斷其是否可靠。而如果醫(yī)院的基礎(chǔ)微生物檢測能力比較弱，就很難解決這個問題。
在 mNGS 應(yīng)用的背景下，傳統(tǒng)微生物檢測應(yīng)該如何發(fā)展、如何去建設(shè)，如何去增強是重點，而不是削弱。很多歐美國家mNGS并沒有完全鋪開，但是他們的診療工作卻開展的很好。從這個角度分析，基礎(chǔ)的微生物檢測能力是非常重要的。
mNGS加深了人們對鸚鵡熱衣原體、人皰疹病毒(1~8型)、鉤端螺旋體、少見NTM與隱球菌等病原體的認(rèn)識。但是數(shù)據(jù)庫比對的結(jié)果是否可靠、是否是病原體，如果是病原體是否需要治療，是否達(dá)到感染的標(biāo)準(zhǔn)，還需要更深入的探討。
往往更需要和傳統(tǒng)方法(常規(guī)微生物鏡檢與培養(yǎng)、組織病理染色、影像學(xué)等)相結(jié)合。
三、靶向測序(tNGS)
靶向測序(tNGS)基于超多重PCR技術(shù)，可進(jìn)行靶向病原檢測，突破病原檢測的局限性。
(一)特異性增加目標(biāo)病原體核酸序列數(shù)和比例，提高目標(biāo)微生物的支持reads數(shù)和覆蓋度，保證難檢/苛養(yǎng)/低載量病原的檢出。
(二)毒力基因的檢測：為區(qū)分致病菌和定植菌提高基礎(chǔ)。
(三)耐藥基因的檢測：與致病病原、耐藥表型相合。
由于靶向測序(tNGS)靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測成本低且相對快速，其在結(jié)核及結(jié)核耐藥檢測、腦脊液病原體鑒定、早產(chǎn)兒下呼吸道感染的診斷等領(lǐng)域都有極高的價值。靶向測序(tNGS)代表了很重要的一個發(fā)展方向，特別是對無需檢測過多病原體的患者。
四、宏基因組測序(mNGS)與靶向測序(tNGS)的選擇
(一)mNGS在發(fā)熱待查、不明原因感染或發(fā)熱、排除感染以及對罕見、疑難、反復(fù)、慢性感染的診斷有很大的幫助
(二)tNGS可以針對基層群體/常見感染患者的常規(guī)檢測手段，包括但不限于各種系統(tǒng)社區(qū)獲得性感染、醫(yī)院獲得性感染等。
超多重PCR(正向富集)+高通量測序(NGS)的靶向測序(tNGS)技術(shù)可以滿足98%臨床應(yīng)用場景，可以實現(xiàn)DNA和RNA共檢，無需分開送檢。
具有快(實驗TAT最快12h)、敏(敏感度優(yōu)于mNGS)、廉(高性價比)、定(病原精確定量)的特點。
(三)下呼吸道感染需要綜合診斷
下呼吸道感染需結(jié)合實驗室病原學(xué)檢測、影像學(xué)、臨床癥狀、病理學(xué)以及生物標(biāo)記物和急性相炎癥反應(yīng)指標(biāo)等綜合診斷。
而mNGS/tNGS/多重分子檢測的未來我們認(rèn)為：
<10個靶標(biāo)、小panel，可使用熒光PCR技術(shù)(Gene Xpert);
10-50 個靶標(biāo)、中小panel，可使用微流控POCT(Filmarry);
200-1000個靶標(biāo)、中panel，可使用panel tNGS;
無預(yù)定靶標(biāo)、大panel，可使用mNGS。
來源：SIFIC感染科普筆記
